مقاله کامل درباره دستگاه HPLC (کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا)

مقدمه

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography یا HPLC) یکی از روش‌های پرکاربرد در شیمی تجزیه برای جداسازی، شناسایی و تعیین مقدار ترکیبات در نمونه‌های مختلف است. این تکنیک در صنایع دارویی، غذایی، زیست‌محیطی و شیمیایی نقش مهمی ایفا می‌کند.

اجزای اصلی دستگاه HPLC

پمپ (Pump) و انواع آن

پمپ‌ها نقش کلیدی در حرکت دادن فاز متحرک (حلال‌ها) در سیستم HPLC دارند و عملکرد آن‌ها بر دقت، تکرارپذیری و بازتولیدپذیری آنالیز تأثیر مستقیم دارد. انواع پمپ‌ها و کاربردهای آن‌ها:

• پمپ ایزوکراتیک (Isocratic Pump): این نوع پمپ، فاز متحرک با ترکیب ثابت را در طول آنالیز تأمین می‌کند. برای جداسازی‌هایی که ترکیب حلال نیاز به تغییر ندارد، مناسب است. سادگی در استفاده و نگهداری از مزایای آن است.
• پمپ گرادیان (Gradient Pump): قابلیت تغییر تدریجی نسبت ترکیب حلال‌ها را دارد و در آنالیزهایی که ترکیب فاز متحرک باید با گذشت زمان تغییر کند (مثلاً برای ترکیبات با قطبیت متفاوت)، استفاده می‌شود.
• پمپ‌های دوتایی (Binary Pump): ترکیب دو حلال را با دقت بالا ایجاد می‌کند. در آنالیزهای نیازمند دقت بالا در کنترل گرادیان، مانند داروسازی، پرکاربرد است.
• پمپ‌های چهارگانه (Quaternary Pump): قابلیت ترکیب چهار حلال مختلف را دارد و برای کاربردهایی با تنوع زیاد در ترکیب فاز متحرک مفید است، مخصوصاً در توسعه روش‌های آنالیتیک.

پمپ مسئول حرکت دادن فاز متحرک از طریق ستون HPLC است. انواع پمپ‌ها شامل:
– پمپ ایزوکراتیک: با فاز متحرک ثابت
– پمپ گرادیان: امکان تغییر ترکیب فاز متحرک در طول زمان
– پمپ‌های دوگانه (Binary) و چهارگانه (Quaternary) برای دقت بالا در ترکیب حلال‌ها

دتکتور (Detector) و انواع آن

دتکتورها مسئول شناسایی و اندازه‌گیری ترکیبات جداشده از ستون هستند. هر نوع دتکتور مناسب کاربرد خاصی است:

• دتکتور UV/VIS: رایج‌ترین دتکتور که جذب نور در طول‌موج‌های مرئی و فرابنفش را اندازه‌گیری می‌کند. برای ترکیبات دارای کروموفور مانند داروها، مناسب است.
• دتکتور DAD (Diode Array Detector): مشابه UV/VIS اما قابلیت ثبت طیف کامل هم‌زمان را دارد. برای بررسی چند آنالیت یا تحلیل طیفی بسیار مفید است.
• دتکتور فلورسانس (FLD): بسیار حساس، برای ترکیباتی که فلورسانس طبیعی دارند یا قابل نشاندار شدن با مواد فلورسانس هستند. در آنالیز سموم و متابولیت‌ها کاربرد دارد.
• دتکتور شکست نور (RID): برای ترکیباتی که جذب UV ندارند مانند قندها و الکل‌ها. دقت کمتر اما برای آنالیت‌های خاص کاربردی است.
• دتکتور طیف‌سنج جرمی (MS): قدرتمندترین نوع دتکتور، قابلیت شناسایی دقیق و تعیین ساختار شیمیایی ترکیبات را دارد. در پژوهش‌های پیشرفته، فارماکوکینتیک و آنالیز پیچیده کاربرد دارد.

دتکتورها برای شناسایی ترکیبات خروجی از ستون به کار می‌روند. انواع آن:
– دتکتور UV/VIS
– دتکتور DAD (Diode Array Detector)
– دتکتور فلورسانس (FLD)
– دتکتور شکست نور (RID)
– دتکتور طیف‌سنج جرمی (MS)

ستون (Column)

ستون بخشی کلیدی است که ترکیبات در آن جداسازی می‌شوند. جنس بستر آن معمولاً از سیلیکا با پوشش‌های مختلف است.

اتو سمپلر (Autosampler)

اتو سمپلر برای تزریق خودکار و دقیق نمونه‌ها استفاده می‌شود و قابلیت افزایش دقت و تکرارپذیری نتایج را دارد.

روش کار دستگاه HPLC

نمونه از طریق اتوسمپلر به فاز متحرک تزریق شده و به سمت ستون هدایت می‌شود. در ستون، ترکیبات بر اساس برهم‌کنش با فاز ساکن جدا می‌شوند و در انتها توسط دتکتور شناسایی می‌گردند.

انواع روش‌های کروماتوگرافی در HPLC

– Normal Phase: فاز ساکن قطبی و فاز متحرک ناقطبی
– Reverse Phase: فاز ساکن ناقطبی و فاز متحرک قطبی (پرکاربردترین نوع)
– Ion Exchange: جداسازی بر اساس بار یونی
– Size Exclusion: جداسازی بر اساس اندازه مولکولی

نکات مهم در نگهداری و کالیبراسیون دستگاه

شامل کالیبراسیون منظم دتکتور، بررسی نشت حلال، شست‌وشوی ستون، تعویض فیلترها و بررسی دقت اتوسمپلر است.

کاربردهای HPLC در صنایع مختلف

– صنایع دارویی: کنترل کیفیت، آنالیز داروها
– صنایع غذایی: بررسی افزودنی‌ها، نگهدارنده‌ها
– محیط زیست: شناسایی آلاینده‌ها
– تحقیقات بیوشیمیایی: بررسی پروتئین‌ها و متابولیت‌ها

نتیجه‌گیری

HPLC یک تکنیک قوی، دقیق و قابل اعتماد برای آنالیز ترکیبات شیمیایی است. با شناخت کامل اجزای آن، می‌توان عملکرد بهینه‌تری از دستگاه داشت.